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实验室中如何运用Whatman 离子交换纤维素
点击次数:969 发布时间:2017-03-14

实验室中如何运用Whatman 离子交换纤维素

有关如何使得介质获得很好结果,Whatman公司已为蛋白质、酶和核酸片断等生物多聚物的有效分离特别开发了一系列Whatman离子交换纤维素。在使用时只有确实按注意事项操作才能得到很好结果。

介质种类

类型

阴离子交换

阳离子交换

物理形态

干品

DE23

CM23

纤维状

DE32

CM32

微粒状

预溶胀

DE51

DE52

DE53

QA52

CM52

 

 

SE52

SE53

比52型结合力较弱的微粒状

微粒状

比52型结合力强的微粒

全离子化微粒

比52型结合力强的全离子化微粒

交换剂的预处理

1.预溶胀(51,52和53型)型离子交换剂不用预先反复处理就可使用。但必须用缓冲液使充分平衡。预溶胀的离子交换剂在每次预处理或再生后使用时不要用任何方法使它变干。

2.为了得到尽可能好的结果,对干的离子交换纤维素(23和32型)预处理的每一步必须按下面将介绍的那样进行操作。

3.DE51、QA52、SE52和SE53含防腐剂。它会在平衡和装柱时自动随之除去。如果离子交换剂还进行平衡,防腐剂可以用蒸馏水或脱离子水洗涤。

一般操作注意点

苹果彩票注册*离子交换剂可以在室温下贮存。

*当不用时可以一直密封保存。

*可以用蒸馏水,更好地是用脱离子水。

*为了避免交换剂变细,不可以激烈摇动或搅动交换剂悬液。

*为了延长使用期离子交换剂不可以用浓酸、浓碱或强氧化剂处理。为了再生,灭菌和去热原介质可以用0.5N-2.0N NaOH处理48小时。

*离子交换剂在没有缓冲液或多聚电解质又不添加防腐剂情况下不要超过一星期,阳离子交换剂(CM和SE类)采用0.1%(W/V)叠氮钠、0.1%(W/V)2.2二硫双(氧化吡啶)或0.02%(W/V)乙基汞硫化水杨酸钠。阴离子交换剂(DE和QA类)用0.2%(W/V)烷基—二甲ji-苄ji氯化铵。

 

*部分 干型离子交换纤维素

预处理

1.称重的离子交换剂加到15倍容积(W/V)酸或碱液中轻轻搅动,进行*次处理。

2.微粒产品至少浸留30分钟,纤维状产品浸60分钟。

3.滤出或滗出上清液,用水洗至下列"中间pH"。

4.再用15倍容积的二次处理用酸或碱液浸泡交换剂,放置30分钟,滤出上清液。

5.重复上述"4"二次处理,然后用水洗至洗液呈中性。

处理条件

型号

一次处理

中间PH

二次处理

DE

0。5N HCl

4.0

0.5N NaOH

CM

0.5N NaOH

8.0

0.5N HCl

注意:对预溶胀的微粒状产品(51.52和53型)不需进行这一步,因此干型产品用在大规模柱分离更好。

第二部分 预溶胀型离子交换纤维素和预处理后的干型离子交换纤维素

交换剂悬液的准备

一般QA52型和SE52型全离子化交换剂在用低离子浓度缓冲液平衡时比DE52和CM52型处理时间更短就可达平衡。

苹果彩票注册而且所有介质当采用的缓冲离子是共有离子时所需平衡容积zui少,也就是与离子交换剂相一致的缓冲液,例如采用三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐缓冲液(TrisHCl buffers)对DE或QA型离子交换剂平衡所需时间和容积都要比用醋酸盐类缓冲液少。

所有情况下实际采用的起始缓冲液浓度比需要的起始缓冲液浓度高(典型的高10倍),这样有利于交换剂的预平衡。下面介绍的是更可取的平衡方法。

离子交换剂装柱后在进样品前必须用低离子浓度的缓冲液进行平衡,通常将2~4倍柱床容积的低浓度缓冲液通过填充柱就可完成平衡。

 

推荐的方法

1。在使用之前用缓冲液的浓溶液(0。2-1。0M)轻轻摇动搅起离子交换剂2-3分钟。zui初取干型纤维素时每克干品约用15~30ml缓冲液,湿离子交换剂约用6ml/g

2.在搅动下缓冲液的酸或碱成分使缓冲液/离子交换剂悬液的pH调到所希望的值。

3.让悬液沉降并倾出上清液中的细小子。

4.再次用缓冲液使离子交换剂松散。干型离子交换剂悬液的总容积按30ml/g计,湿离子交换剂约为6ml/g.

5。离子交换剂和缓冲液的悬液在合适的量筒中沉降,并置于无灰尘、无直射阳光和不发热的地方。沉降时间可按t=nh式计算。式中:t=时间(分), h=量筒中悬液总高度(公分),n=系数可取1。3~2。4。

6.注意"湿沉降容积"是离子交换剂在规定条件下沉降后所占容积。除去上清液中所含细粒后留在量筒中的zui终容积是"湿沉降容积"加20%。

苹果彩票注册填装短柱或长柱时悬液可以选用上述密度,但是纤维状产品的长柱床的密度需用"湿沉降容积"加50%

 

变换缓冲液可用方法

1.按上项(1)那样轻轻搅起离子交换剂到一定容积的缓冲液中。

2.放置10分钟,倾出或滤出上清液。

3.重复处理直到滤液或上清液确实与缓冲液的PH和电导率一样为止。变换缓冲液后必须核对PH等。当采用低浓度缓冲液时本方法会有所变化,且需要增加处理的时间。

4.除去细颗粒和装柱的准备工作请按上述(4)(5)和(6)项进行。

 

装柱

在装柱时必须避免离子交换剂和缓冲液悬液的对流翻动。

为此必须使悬液倒入柱中瞬间离子交换剂形成沉降柱床层,操作进行得尽可能快,否则悬液中的对流需很长时间才会停下来。

1、离子交换用柱应垂直置于无灰尘、无直射阳光和不发热等环境中。

2、假如悬液容积大于柱容积时应接一段延长管。

3、轻轻搅动下将悬液倒入柱中。

4、让洗脱液从柱中排出。

5、全部悬液加完后装上或插入柱顶盖。

6、缓冲液用泵或流动法通过柱,流速控制至少45ml/hr/cm²柱内截面积,直到柱床高度恒定。

7、停止缓冲液流进或流出柱。

8、取下延长管(若装着)并换上柱顶盖。

 

平衡

需强调的是必须正确读取pH和电导率。

对真正的平衡而言平衡后的溶液应与起始缓冲液一致。必须做倒不仅连续两次平衡溶液的读数相同,而且要与起始缓冲液相同。不正确的平衡常是产生无重现性结果的原因。

起始缓冲液流过柱直到流出液的电导率和pH地与起始缓冲液相同。此方法适于开始时用低浓度缓冲液的柱分离。

 

样品准备和加样

样品溶于起始缓冲液中并调整溶液的pH。细胞提取物和硫酸铵沉淀物要用层柱起始缓冲液透析。这一步不注意就有可能得到无法重现的结果。混合物通常在控制流速下加到柱上。

洗脱

加样品后立刻开始洗脱或在规定时间下开始。

通常有三种方法层析分离。有分步洗脱,连续梯度洗脱和分段梯度洗脱。

分步洗脱

离子交换剂平衡和样品混合物准备时所用缓冲液也可在洗脱时用,洗脱可以两种方式完成:

1.目的物分子是游离状态的。所需离子交换剂量要根据混合物污染程度、结合力和成分而定。柱床高度在这种方式操作并不重要。

2.目的物分子是结合状态的。层析时混合物是由相类似的成分组成的,为了获得很好操作应选用相对长些的柱。可取的是只用了柱总容量的很小一部分(如5%)。

应避免离子交换剂平衡和柱中层析分离两者选用不同的缓冲液,除非系统已经明确显示出会得到错误的结果时才考虑。

梯度洗脱

连续地或分段地改变缓冲液的组分用于有效分离。缓冲液的组分变化可以是提高一种离子浓度或改变适当的pH,或者两者都改变。缓冲液本身是达到分离目的的主要因素,离子交换剂的量需要按离子交换剂对目的化合物的交换容量而定。万一混合物含层析相近似的组分时,为了获得好的分辨力需要增加些柱的长度。

 

特殊技术

灭菌

所有Whatman离子交换介质除P11型之外为了灭菌都可以高压灭菌,zui好是离子交换剂用pH6.5-7.5的非挥发性缓冲液配成的悬液中进行。

建议的灭菌条件是10psi 15分钟,或15psi10分钟。另外除P11型之外所有的产品也可以用化学灭菌法,将介质分散在0.5M NaOH中,然后用灭菌水洗涤。所有产品也可用含20~25%体积百分比的乙醇水溶液处理。

脱气(对阴离子交换剂)

对大多数灵敏的分离,为了获得重现性好的结果,DE和QA纤维素交换剂需除去吸附的二氧化碳。假如悬液预先按上述推荐的方法处理过后一般就不必进行这一步。

1. 将纤维素加到酸性缓冲液中。

2. 调整pH在4.5。有时甚至要用更高浓度的酸溶液来调节pH。

3。 在搅拌下抽真空(压力降至10cmHg以下)直到没有更多的气泡产生,在不产生沸腾之后停止真空。较合适的是在抽滤瓶中带磁力搅拌器搅拌下进行,抽滤瓶与吸气器相连。

4. 加碱性缓冲液使达所希望的pH。对要求更高的分离,所用缓冲液必须用除CO2和水配置以保证无CO2。

 

采用含醇缓冲液

苹果彩票注册对SE53型介质需用含醇缓冲液,平衡时先用水缓冲液处理,然后再用含醇缓冲液系统完成平衡。

 

分批法离子交换

1,将一定量的已预处理并平衡过无细粒的离子交换剂加到原溶液中。

2,按原溶液中所含成分的容量搅动一定时间进行吸附分离。

3,用过滤法或离心法将离子交换剂和缓冲液分开。

4,用平衡时所用缓冲液洗涤离子交换剂。

5,在搅动流化床下或离心下解吸,也可以将纤维素装柱后用上述洗脱技术进行解吸。

有关Whatman 离子交换纤维素介质大规模分离应用请与Whatman 国际公司。公司联络地址:SpringfieldMill ,Maidstone,Kent.ME142LE,England.

 

Whatman 离子交换介质的在位清洗方法

在许多运作中,Whatman 分离介质能多次使用。为保持其再生的水平,建议采用下述在位清洗的方法:

1. 用2柱子容量的0.5M浓度的氢氧化钠溶液清洗,并在室温下浸泡12小时;

2. 用2柱子容量的除矿质水清洗;

3。 用2柱子容量的四倍浓度的起始缓冲液清洗;

4. 用6柱子容量的起始缓冲液平衡柱子。

上述清洗过程种可清除吸附在柱内的蛋白质和类脂物,并不会影响层析的特性或介质的稳定性。介质的消毒亦在此过程中得以完成。即使对严重污染的介质亦是有效的。

如果上述清洗未能产生效果,可用浓度较高的氢氧化钠溶液(可达2M NaOH)。在这种情况下,介质与氢氧化钠接触的时间可以减小。

 

贮藏方法:

如果介质需要贮藏亦个较长的时间,可采用下述方法以确保产品的特性。

在柱内或象散装泥浆似的贮藏离子交换纤维素,建议用下述抑菌剂,pH范围为3-11:

基团 建议用抑菌剂

DE或QA 0.2%W/V Benzalkonium Chloride

苹果彩票注册CM或SE 0.1%W/V 叠氮钠或

0.1%W/V 二硫双(吡啶-N-氧)或

0。02%W/V 硫柳汞

P11 0.1%W/V 二硫双(吡啶-N-氧)

 

证书:

Whatman 所有型号的离子交换介质都已获得美国食品和药物管理局(FDA)颁发的DMF(Drug MasterFile)证书。如:

DMF11103 快速离子交换介质D 

DMF11102 快速离子交换介质Q

DMF11101 快速离子交换介质S

DMF11100 快速离子交换介质C

因此,若需要药证生产的产品,Whatman 离子交换介质能容易地获准用于药物生产业的层析分离。

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