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Millipore的超滤管使用经验
点击次数:610 发布时间:2018-07-30

蛋白浓缩和换 Buffer 通常使用的超滤管,可重复使用,使用一次就扔掉太浪 费。常用 Millipore 的 Amicon-Ultra-15 超滤管(MWCO10kD) 。也有其它型号 的、 不同体积大小和 MWCO 超滤管可选,视目的蛋白的分子量与浓缩前体积、浓缩 目标体积而定。以下是个人总结的使用方 法和注意事项。

1、选择合适的超滤管,主要考虑 MWCO 和浓缩体积,常见的是 Ultra-15 (10kD) 。到底选择多大截留分子量比较合适呢?10kDa、 5kDa、还是 30kDa? 通常应截留分子量不应大于目的蛋白分子量的 1/3 ,比如目的蛋白分子量为 35kDa,就可以选择 10kDa 截留分子量的超滤管。若目的蛋白分子量为 10kD 左 右,则可以用截留分子量 3kD 的超滤管。认真阅读使用说明书,注意超滤膜对 各种化学物质的耐受程度有所不同,表格中有。

2、新买来的超滤是干燥的,使用前加入 MilliQ 水,水量完全过膜,冰浴或冰 箱里预冷几分钟。然后将水倒出,即可加入蛋白液,加入的多少,以不超过管顶 的白线为准。操作要轻,加入蛋白液前,超滤管需要插在冰上预冷。

3、平衡。质量和重心二者都要达到平衡。注意转速和加速度不可太快,否则 直接损坏超滤膜。开始离心超滤(离心机预冷至 4 度) 。不同离心机的转速 rpm 换算成 g 之后,有所不同。具体可参阅附件里的说明书。离心机的加速度调至 低档, 减小对膜的压力。 注意, 一定要等离心机达到目的转速之后, 方可离开 离 心机,否则离心机出问题时,无法时间处理,后果不可预测!膜与转轴的方 向根据说明书调整(角转离心机的情况是膜与轴垂直) 。在实际使用中,一般转 速 开的比说明书里的要低,这样可以延长离心管的使用寿命。

4、当浓缩到剩下 1ml 时, 【取 50ul 国产 Bradford 溶液,加入 10ul 流穿,看有 没变蓝色,以此判断超滤管是否漏掉蛋白。如果管漏了,将上层和流穿重新倒入 新管中开始超滤。要判断是否漏管,用 5mgml 的 BSA 离心 10min,再取流 穿,跑蛋白胶或 Bradford 粗测】 ,继续加入剩下的蛋白液浓缩(在冰上操作,防 止蛋白受热) , 直到所有浓缩液都加完为止。离心过程中注意是否发生蛋白沉淀, 导致堵管。若发生沉淀,要确定沉淀的具体原因,是蛋白浓度过高还是 Buffer 不合适;前者可用多根超滤管同时超滤,降低浓度的办法解决,后者的方法是换 不同的 Buffer,直到蛋白不发生沉淀为 止。

5、前面几步用以浓缩蛋白,如果要换 Buffer,在总蛋白液浓缩至 1ml 左右的 时候,轻轻加入新的 Buffer(经 0.22um 超滤膜超滤) ,再 浓缩至 1ml 左右,连续 三次,后一次的浓缩终体积根据需要的蛋白浓度而定,一般不多于 500ul,也 有浓缩至 200ul 以内的情况。按照每次至少 10 倍 左右的体积浓缩算,三次达到 1000 倍以上,基本上可以达到换 buffer 的目的。

苹果彩票注册6、取出终蛋白浓缩液的操作在冰上操作,用黄枪头(200ul)取,轻轻顺着 边缘插入枪头,轻轻吹打、混匀蛋白液,注意不要碰到超滤膜,然后吸取 浓缩 液,每次吸接近 200ul,直到吸完。管底剩下的后一点浓缩液不必吸取,否则 难度太大,有可能损坏超滤膜。后加入 MilliQ 水到超滤管中,没过 超滤膜, 防止膜失水变干。

7、以下是处理超滤管,重复利用超滤管的步骤。

8、 倒出超滤管里的水, 用 milliQ 水轻轻润洗几次, 【若管底有可见的蛋白沉淀, 可以先加入水, 然后用枪头吹打, 注意不要碰到膜, 吹打至沉淀悬起, 然后倒掉, 不可用自来水猛冲】然后加入 0.2M 的 NaOH 溶液,室温放置 20min,期间平衡 超滤管。再离心 10min。倒出残留的 NaOH 溶液,将 管芯浸入 MilliQ 水的烧杯 (1 或 2L)中,放置几个小时,再换新的水,放置几个小时, 不断稀释 NaOH 浓度。 50ml 管和盖子用自来水洗,内壁再用 MilliQ 水洗干净。

9、取出浸没的管芯,加至接近满的 MilliQ 水,50ml 管也加满 MilliQ 水,将管 芯慢慢放入 50ml 离心管,排出部分水,然后盖上盖子,放 4 度保存,直到下次 使用。一般来说,按照上述步骤和注意事项,每根管用三四年不会坏。

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